细胞复苏的步骤丁香园 (细胞复苏的步骤和原理)

转眼间又是一个开学季。你还记得我们开始上学的那些年吗？从小时候想上学，到中学开学前赶作业，再到现在为了我们的实验数据在实验室熬通宵。研究员们，你们准备好了吗？你的细胞准备好了吗？

开学季也是细胞的恢复季。如果你对细胞恢复还没有一个清晰的概念，请收集这篇文章，在每次恢复前复习一下。

细胞复苏就像鸡蛋炒饭，最简单也最难。只要有一步出错，就会导致细胞损伤甚至死亡，从而整个实验都会失败！

细胞恢复的第一点是快速融化。我们要尽快将细胞从-178℃解冻到37℃，尽量避免冰晶进入细胞，然后在慢慢融化时形成晶体，从而对细胞造成损伤。

具体操作过程有八个步骤:

①手术准备

1)将无菌超纯水加热至37℃，保存在无菌玻璃瓶中备用；

2)提前进行细胞实验室常规消毒，紫外线照射30min以上，用75%酒精擦拭超净台及各类设备，保证无菌操作环境；

3)放置各种枪头、离心管、培养瓶、废液罐等。这些需要使用的物品经过高温高压灭菌后，按顺序摆放在超净桌面上。

②细胞转移

1)根据细胞冻存时储存的数量确定细胞的储存位置；

2)穿戴好防护装备后，将细胞从液氮中取出，检查细胞数量；

3)快速将细胞转移到手术室空。如果步行距离超过1分钟，就要准备干冰运输。

③细胞解冻

1)将细胞冻存管快速放入37℃的无菌超纯水中，快速振荡解冻；

2)解冻1-2min，待液体完全溶解后，用酒精棉球擦拭冷冻管外壁，然后放入超净台。

④离心清洗

1)将细胞溶液加入到完全培养基中，充分吹扫、混合、平衡；

2)将离心管以3000转/分钟离心3min，并清洗两次以去除DMSO。

⑤悬浮液的制备

1)弃去上清液，再次加入10ml完全培养基；

2)用移液管完全吹匀后，制成细胞悬液。

⑥计数观察

1)取适量悬液进行染色和计数，计算细胞活力和生存力；

2)在显微镜下观察细胞，确定细胞的特异性回收。

3)细胞浓度应保持在5*105。

⑦培养细胞

1)将观察后适合培养的细胞分装于每个培养瓶中；

2)对每个培养瓶做好标记，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养24-48h，然后换液或传代培养。

⑧记录时间

1)记录细胞在培养瓶中的时间，方便换液和记录传代。

细胞复苏技巧技巧:

1.操作液氮时，应采取完整的防护措施，避免直接接触液氮造成伤害。

2.取出冻存管后，要检查是否密封。如果没有完全密封，液氮进入管内解冻会造成爆管。

3.DMSO在室温下会对细胞产生毒性，解冻要快。解冻后应尽快加入少许培养基稀释离心。

4.每次移液后都需要更换枪头，以避免溶液交叉污染。

5.解冻前后的培养基血清需要一致，如有更换需要梯度更换。

判断细胞复苏成功与否的关键是看复苏后细胞的存活率以及之后的生长情况。以贴壁细胞为例，复苏后细胞贴壁率可达95%以上，说明细胞活性良好，复苏操作过程达标。

相信通过这篇文章的学习和巩固，大家一定能更快成为一名合格的细胞培养者！